核基因組突變是多種疾病的根源，而線粒體作為細胞內(nèi)具有半自主功能的細胞器，擁有獨立的基因組，其基因組突變同樣與多種遺傳疾病密切相關(guān)。線粒體疾病通常累及多種組織器官，其中最為人熟知的包括Leigh綜合征和LHON（Leber遺傳性視神經(jīng)病變）。Leigh綜合征的癥狀包括發(fā)育遲緩、肌張力減退、運動和呼吸障礙等，而LHON則表現(xiàn)為視力喪失、中央暗點和視神經(jīng)萎縮等問題。根據(jù)MITOMAP的統(tǒng)計，目前已驗證的線粒體致病性突變有97個，其中點突變占比高達95%。然而，由于缺乏有效的點突變相關(guān)線粒體疾病小鼠模型，線粒體疾病的研究與治療開發(fā)受到了嚴重制約。

早期的小鼠模型主要通過化學誘導(dǎo)或遺傳工程構(gòu)建，但這些方法操作復(fù)雜、成本高昂且對突變的精準控制較差，僅成功建立了極少數(shù)模型。近年來，研究人員成功開發(fā)了線粒體堿基編輯工具，可以對線粒體DNA實現(xiàn)C到T和A到G的編輯，例如DdCBEs和TALEDs。這些工具基于雙鏈DNA脫氨酶DddA蛋白。雖然已有研究者嘗試將這些工具應(yīng)用于小鼠模型的構(gòu)建，但其編輯效率尚不足以模擬人類線粒體疾病中高突變負荷的特征。此外，研究表明DdCBEs可能引發(fā)大量核基因組脫靶效應(yīng)，這種非TALE依賴性的脫靶主要源于DddA蛋白的自組裝以及其與CTCF的相互作用。因此，基于DddA的線粒體堿基編輯工具在應(yīng)用中面臨核基因組脫靶的風險，難以直接建立線粒體突變與疾病表型之間的因果聯(lián)系。

針對這一挑戰(zhàn)，北京大學魏文勝課題組之前開發(fā)了mitoBEs，這是一種結(jié)合切口酶與單鏈DNA脫氨酶的新型線粒體堿基編輯工具，能夠?qū)崿F(xiàn)線粒體DNA的C到T和A到G編輯。與DdCBEs和TALEDs相比，mitoBEs展現(xiàn)出卓越的鏈特異性和顯著降低的脫靶效應(yīng)。得益于其雙向堿基編輯能力，mitoBEs能夠?qū)Υ蠹s87%的致病線粒體突變進行精確建模。

2025年1月22日，北京大學及昌平實驗室魏文勝課題組在Nature雜志在線發(fā)表了題為“Precise modelling of mitochondrial diseases using optimized mitoBEs”的研究論文。該研究報道了通過優(yōu)化后的mitoBEs實現(xiàn)高效且精準地構(gòu)建線粒體疾病小鼠模型的成果。利用優(yōu)化版mitoBEs，研究團隊成功建立了具有高突變頻率的小鼠模型，這些模型表現(xiàn)出了與疾病相關(guān)的典型表型。此外，通過雜交實驗，還獲得了突變負荷達到100%以及僅含單堿基突變的精確小鼠模型。

為準確建立突變與疾病表型之間的直接聯(lián)系，消除堿基編輯工具的脫靶效應(yīng)尤為重要。在利用mitoBEs進行建模時，需要將RNA編碼的mitoBEs注射到小鼠受精卵中。因此，該研究首先對RNA編碼的mitoBEs系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)進行了全面評估。結(jié)果表明，RNA編碼的mitoABE存在廣泛的轉(zhuǎn)錄組脫靶效應(yīng)，而mitoCBE則表現(xiàn)出一定程度的依賴于APOBEC1蛋白的線粒體基因組脫靶效應(yīng)。為了提高mitoBEs的精準性，該研究重點優(yōu)化了脫氨酶。針對mitoABE，通過突變篩選發(fā)現(xiàn)，TadA8e-V106W-V28F能夠顯著降低轉(zhuǎn)錄組脫靶至背景水平（圖1）。針對mitoCBE，篩選了多種現(xiàn)有的胞嘧啶脫氨酶，并發(fā)現(xiàn)TadA衍生的胞嘧啶脫氨酶CBE6d在線粒體基因組上表現(xiàn)出的脫靶效應(yīng)接近背景水平。基于這些優(yōu)化成果，研究團隊將改進后的mitoBEs命名為mitoBEs v2，包括mitoABE v2和mitoCBE v2（圖1）。此外，該研究還系統(tǒng)性地評估了優(yōu)化前后mitoBEs在核基因組上的脫靶效應(yīng)，結(jié)果顯示，無論是優(yōu)化前還是優(yōu)化后的mitoBEs，均未在核基因組上引發(fā)明顯的脫靶效應(yīng)，從而驗證了其在基因編輯中的安全性和可靠性。

圖1 優(yōu)化mitoBEs的編輯精準性

通過將85個人類致病性線粒體DNA點突變與小鼠線粒體基因組進行同源性比對，研究確定了70個可編輯位點。進一步的細胞水平初步篩選成功實現(xiàn)了其中68個位點的編輯。比較發(fā)現(xiàn)，由環(huán)狀RNA（circRNA）編碼的mitoBEs v2相比于mRNA編碼的工具，具有更高的編輯效率。因此，研究團隊將circRNA編碼的mitoBEs v2注射至小鼠胚胎并進行移植，結(jié)果顯示mitoBEs v2在多種F0代小鼠模型中均實現(xiàn)了較高的編輯效率，其中 mt-Nd5 A12784G F0小鼠模型的突變頻率高達82%（圖2）。此外，該研究系統(tǒng)性評估了F0代小鼠在線粒體基因組和核基因組中的脫靶效應(yīng)，結(jié)果表明，在整個基因組范圍內(nèi)未檢測到脫靶效應(yīng)。這一發(fā)現(xiàn)表明，mitoBEs v2能夠構(gòu)建遺傳背景干凈的線粒體疾病小鼠模型。更重要的是，線粒體基因組的編輯結(jié)果在小鼠不同組織中表現(xiàn)出廣泛且持久的存在（圖2），并且能夠通過母系遺傳穩(wěn)定傳遞。通過進一步雜交實驗，研究成功獲得了目標位點編輯效率達到100%以及僅含目標位點突變的 mt-Nd5 A12784G小鼠模型。

圖2 mitoBEs v2高效構(gòu)建線粒體疾病小鼠模型，編輯結(jié)果廣泛且持久穩(wěn)定于多組織

mt-Atp6 T8591C和 mt-Nd5 A12784G分別對應(yīng)人類線粒體致病突變m.T9191C和m.A13379G，并分別導(dǎo)致Leigh綜合征和LHON。研究團隊對突變率較高的F0代小鼠進行了疾病表型評估，結(jié)果顯示， mt-Atp6 T8591C小鼠表現(xiàn)出顯著的心臟功能障礙，與Leigh綜合征的臨床特征相符；mt-Nd5 A12784G小鼠則表現(xiàn)出類似LHON的視力障礙（圖3）。此外，研究還通過調(diào)整TALE結(jié)合位點，成功構(gòu)建了僅含目標位點編輯的單堿基突變 mt-Nd5 A12784G小鼠模型。這些研究結(jié)果充分證明了mitoBE v2在創(chuàng)建線粒體疾病小鼠模型方面的高效性和精準性，為深入探索線粒體疾病的致病機制及開發(fā)新型治療策略提供了重要工具。

圖3 小鼠模型呈現(xiàn)出相應(yīng)的線粒體疾病表型

北京大學博士后伊宗裔為該論文的共同通訊作者，昌平實驗室博士后張小雪為論文的第一作者，張雪、任紀武、李佳怡、魏曉旭和于瑩博士也為該研究作出了重要貢獻。本研究得到了昌平實驗室、國家自然科學基金、北大-清華生命科學聯(lián)合中心及中國博士后科學基金的資助。